17羥孕酮Elisa試劑盒是如何進行細胞的凍存與復(fù)蘇
17羥孕酮Elisa試劑盒為了防止因污染或技術(shù)原因使培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細胞因傳代而遲早會出現(xiàn)變異，有時因寄贈、交換和購買，培養(yǎng)細胞從一個實驗室轉(zhuǎn)運到另一個實驗室，的策略是進行低溫保存。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要。現(xiàn)簡要介紹深低溫保存法(－70℃~－196℃)的特點。細胞深低溫保存的基本原理是：在-70℃以下時，細胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于*停止狀態(tài)，故可以保存。細胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷。
1. 細胞的凍存
為避免污染造成的損失，zui小化連續(xù)細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前，細胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。
有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細胞。對于包含有血清的培養(yǎng)基，成分可能如下：
◆包含10%甘油的*培養(yǎng)基，
◆包含10%二甲基亞砜（DMSO）的*培養(yǎng)基，
◆50%細胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%甘油的新鮮培養(yǎng)基，
◆50%細胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。
對于無血清培養(yǎng)基，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是：
◆50%細胞條件無血清培養(yǎng)基和50%包含有7.5%二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基，或
◆包含有7.5%二甲基亞砜和10%細胞培養(yǎng)級BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基。
（1）懸浮細胞
●計數(shù)將要凍存的活細胞。細胞應(yīng)該處于對數(shù)生。以大約200～400 g離心5分鐘沉淀細胞，使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細胞。
●以1×107到5×107細胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細胞，或者以0.5×107到1×107在無血清培養(yǎng)基中，再次懸浮細胞。
●分裝進凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
●細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
（2）貼壁細胞
●使用分離試劑從基層分離細胞，分離時盡可能溫和，使對細胞的損傷減少到zui小。
●在*生長培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細胞，確定有活力細胞數(shù)。
●以大約200 g離心5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細胞。
●以5×106到1×106細胞/ml密度，在凍存液中懸浮細胞。
●分裝進凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
●細胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
2. 凍存細胞的復(fù)蘇
凍存細胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細胞要快速融化，17羥孕酮Elisa試劑盒并直接加入*生長培養(yǎng)基中。若細胞對凍存劑（DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養(yǎng)基，然后加入*生長培養(yǎng)基中。
（1）直接鋪板方法
●取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。
●直接用*生長培養(yǎng)基鋪板細胞。1 ml凍存細胞使用10~20 ml*生長培養(yǎng)基。進行活細胞計數(shù)，細胞接種應(yīng)該至少在3×105活細胞/ml。
●培養(yǎng)細胞12到24小時，更換新鮮的*生長培養(yǎng)基，去除凍存劑。
（2）離心方法
●取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。
●把1到2 ml凍存細胞加入到大約25 ml*生長培養(yǎng)基，輕輕混勻。
●以大約80x g離心2到3分鐘。
●棄去上清。
●在*生長培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細胞，并且進行活細胞計數(shù)。
●17羥孕酮Elisa試劑盒細胞鋪板，細胞接種應(yīng)該至少為3×105活細胞/ml。
